如何把細胞養的更漂亮Ⅲ（污染拯救篇）！看完再也不怕細胞污染！

對于細胞培養防止污染的措施等注意事項，相信各位園子里的朋友們呢都知道的差不多，其實實際情況也就是那些步驟了，主要就是在于各位操作的嫻熟程度了。所以這個預防還是在于大家的鍛煉。我今天主要談細胞污染之后的拯救。繼續我的專題！

7.細胞污染之后的拯救！

對于貼壁生長的細胞，相對來說比較簡單但很麻煩。以下我主要討論貼壁生長的細胞。

在討論之前，大家首先要有一個概念，即潔凈區，并不是沒有**，而是**的數量非常少，國家標準100級的潔凈標準是浮游菌數不得超過5個每立方米，沉降菌數不得超過1個每培養皿.而國外的標準比我國的還要高一點，要求的數量更少。

所以在我們的潔凈操作臺里，并不是真正一個**都沒有的，所以在操作的時候還是要盡量利索迅速地完成操作。盡量減少進入培養體系**的數量。

所以處理**污染的重要原則就是：無限地稀釋**的濃度，無限地減少**的數量！

1）.將污染的培養液倒掉，轉燒瓶口，加入10mlPBS，適當晃動清洗培養瓶，然后倒掉。轉燒瓶口。

2）.繼續加入10mlPBS，同樣方法晃動，清洗培養瓶，然后倒掉。

3）.繼續加入5mlPBS，同樣方法洗瓶，主要是培養面，然后倒掉。

4）.重復步驟3再洗。

5）.重復步驟3再洗。

6）.加入3-5ml雙抗，洗瓶，靜置3-5分鐘，然后吸出。

7）.加入3ml雙抗，洗瓶，靜置3-5分鐘，然后吸出。

8）.再加入5mlPBS洗瓶，然后吸出。

9）.加入10ml培養液，加入2ml雙抗，放置培養箱培養，5小時之后，倒掉培養基，加入PBS洗瓶兩次，然后加入胰酶消化，吹打后置于離心機800-1000r/min離心，然后洗一次。置于新的培養瓶里培養，培養體系加入2ml雙抗。

10）.24h之后，視情況換液，若仍然污染嚴重，培養基渾濁，重復以上步驟，若看不到污染物，則繼續步驟1)、3）、4）、6）、8），然后加入培養液培養，培養體系加入2ml雙抗.

11).24h之后，若仍污染嚴重，可再重復一次，若還污染只能棄之（不過一般沒有出現這種情況），若鏡下不見污染物，則換液PBS洗瓶，正常培養。

以上是對于**污染（常見為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）；若為霉菌或者**污染，加入兩性霉素B清洗和培養，終濃度一般為2.5μg/ml（在30μg/ml時會有細胞毒性）。另外也可以選擇在培養基里加3ug/ml的制霉菌素或放線菌素D。其它操作同；若為支原體或者黑膠蟲污染，因為這個太難處理，所以我基本上都是重新弄細胞了。處理的代價更大更麻煩。但是也是有專門針對黑膠蟲和支原體污染的試劑的，但是我沒有試過。比較貴呵呵。

有同學說用泰樂處理支原體污染效果比較好。大家可以試試，我下次也會試一試。至于黑膠蟲的話，我覺得真的是沒有辦法了，還是需要你在無菌觀念和無菌操作上下大功夫加強了，真的黑膠蟲在科研領域還是很未知的啊。所以沒有什么好的應對方法。預防為主！！還是要強調無菌操作啊！！尤其注意血清的質量！這個是主要來源。一般建議用北美血清，這個黑膠蟲污染會概率小。

以上方法主要是針對貼壁生長的細胞，在操作的過程中，一定要小心操作動作，輕柔緩慢，切忌大動作魯莽。防止細胞脫落。以上方法操作得當，基本上都能救活你的細胞（我還沒有聽到沒救活的反饋）。當然如果你的細胞仍有富余或者凍存的，我還是建議你把污染的扔掉，再復蘇方便省事。這個拯救細胞還是主要針對你就只剩這一瓶細胞無路可退的時候。