著床前小鼠胚胎線粒體功能障礙對著床胚胎與胎盤發育的影響

實驗步驟

1. 胚胎培養基

用含4mg/ml BSA的MOPS-G1工作液收集受精卵。胚胎培養液分對照組培養液與試驗組培養液(G1.2/G2.2，注：G1.2為對照組培養液；G2.2為試驗組培養液)，其基本物質有：維生素和主要的氨基酸以及5%的人血清白蛋白(HSA)。試驗組培養液不含有主要的丙酮酸鹽，添加或不添加梯度的(0.5-500μm)線粒體MAS抑制劑Amino-oxyacetate(AOA)。此試驗組培養液用來引起著床前胚胎不同水平的代謝紊亂。

2. 動物和胚胎收集

21日齡雌鼠CBAxC57BL/6腹腔注射5 IU eCG，48h后注射5 IU hCG，然后與公鼠CBAxC57BL/6合籠。見栓雌鼠，在hCG注射22h后脫頸處死，取輸卵管，在MOPS-G1工作液中撕破膨大部，釋放出卵丘卵母細胞，用0.5 mg/ml的透明質酸酶作用30s，獲得裸卵。

3. 胚胎培養及線粒體功能抑制的體外模型獲得

每20μl G1.2培養液放10枚受精卵，在37℃、5%O₂、6%CO₂條件下過夜培養。

培養22h后，獲得的二細胞胚胎隨機的分成三組，并用相應的培養液清洗：1)對照組：G1.2培養液(C)，2)不含丙酮酸鈉的G1.2培養液，以使胚胎的代謝發生改變，3)含有0.5，5，50 或500μM 抑制劑AOA、不含丙酮酸鈉的G1.2培養液，以抑制線粒體的MAS功能。二細胞胚胎在相應的培養液中培養24h，然后分別換相應的G2.2培養液(±丙酮酸鈉和AOA)進行培養，直到囊胚階段(第5d)。在第四天和第五天統計的胚胎發育率與第五天統計的囊胚情況進行評估分析。

4. 囊胚細胞數目與細胞分配的分析

用Hardy 等的試驗方法，統計囊胚滋養外胚層和內細胞團的細胞數目。孵化期前，囊胚在4℃10mM TNBS中10min，然后在37℃ 0.1mg/ml anti-DNP-BSA中10min，后用37℃黑暗孵育5min以標記滋養外胚層細胞的核；要進一步標記ICM和TE細胞，用含6μg/ml雙苯甲亞胺的乙醇處理，過夜。**天，胚胎用無水乙醇清洗，用甘油包埋，再在紫外熒光顯微鏡下觀察。記錄TE細胞(粉色)和ICM細胞(藍色)的數目，并計算TE/ICM的比率。

5. 計算囊胚細胞凋亡

用一種原位細胞死亡診斷盒來評估囊胚的凋亡。凋亡細胞核用末端脫氧核苷酰基轉移酶介導性dUTP切口末端標記(TUNEL)進行熒光標記；用碘化丙啶標記所有的細胞。細胞總數及凋亡細胞核的數目可以用熒光顯微鏡進行觀察記錄；計算凋亡細胞的數目/相應的細胞總數得到凋亡細胞指數。

6. 計算呼吸率

每枚囊胚的呼吸率被視為線粒體氧化磷酸化能力的一個指標，呼吸率是用胚胎鏡檢測的。用12孔板，每孔中放一枚囊胚；每枚囊胚用各自的培養液作為工作液。將12孔板放到胚胎鏡中，自動記錄O₂消耗量(呼吸率)。當胚胎消耗氧氣時，它能夠在小孔中產生線性的濃度梯度。每個小孔中的氧氣濃度事先用一種自動微傳感器進行了**的周期性測量，以檢測其線性梯度。這濃度梯度用來測量單枚胚胎的呼吸率。胚胎的氧氣消耗量，大約每小時測量一次，連續測量三個小時；呼吸率為這三小時獲得的每枚囊胚每秒鐘消耗的氧氣飛摩爾質量(fmol/sec)。

7. 碳水化合物代謝分析

利用之前所述方法，檢測每枚胚胎經糖酵解途徑的葡萄糖氧化率和經TCA循環途徑的丙酮酸鹽代謝率。每個1.6ml的離心管中放一枚囊胚，然后加入2μl相應的G2.2培養液，培養液中含0.5 μCi的[5-3H]葡萄糖(比活力為88.4mCi/mg)或0.35 μCi 的D-[6-14C]葡萄糖(比活力為302 μCi/mg)。糖酵解率和TCA途徑代謝率分別利用3H₂O 和 14CO₂的產生獲得，并用pmol/h表示。[加的都是葡萄糖，為什么說檢測TCA途徑的丙酮酸鹽代謝率呢？TCA起始物是丙酮酸吧？葡萄糖可轉化為丙酮酸鹽]。

8. ATP和ADP的測定

利用Mitchell等的方法檢測每枚囊胚的ATP、ADP以及ATP:ADP水平。每枚胚胎用100nl含有1mg/ml蔗聚糖的MOPS-G1萃取；然后用20nl 3M高氯酸黑暗孵育10min；之后用80nl 冰 KHCO₃(2M)中和高氯酸。利用己糖激酶和6-磷酸葡糖脫氫酶催化的酶聯**反應或者乳酸脫氫酶和丙酮酸激酶催化的酶聯**反應，經過萃取，用熒光顯微鏡分別對ATP和ADP濃度進行定量分析。ATP和ADP的濃度利用相關標準曲線計算，并用(pmol/每枚胚胎)表示。

9. 胚胎移植

6-12周齡的瑞士雌鼠與結扎公鼠合籠，假孕母鼠懷孕3.5天進行胚胎移植，每只假孕母鼠每側**移入6枚囊胚期胚胎。每只假孕母鼠，隨機的一側**移入對照組胚胎，另一側移入試驗組胚胎(-P或是AOA)。胚胎的著床能力在小鼠懷孕的第18天，通過著床胚胎數量以及胚胎和胎盤情況的檢測來評價。