磷酸化蛋白Western Blot的注意事項

• 關于/磷酸化蛋白樣品，裂解液問題

• 蛋白的磷酸化是一個非常迅速的反應，所以取樣品的過程要迅速，樣品要新鮮，樣品處理*好在冰上操作，操作時間盡量短。用PBS洗滌細胞時，PBS一定要4℃預冷。如果是組織的話，提取蛋白時采用液氮研磨的方法，研磨器具*好提前預冷，保持低溫的狀態。
• 提取磷酸化蛋白的裂解液*好是新鮮配制，裂解液中一定要有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，否則即使條帶壓出來也會很淺，結果也不可信。okadaic acid，NaF是磷酸酶抑制劑。再者，還要看你檢測的蛋白磷酸化位點是什么氨基酸，如果是酪氨酸還要加1 u M的sodium vanidate即原釩酸鈉，上樣前不要煮沸，煮沸可能會破壞其磷酸化位點。
• 提取的磷酸化蛋白一定要妥善保存，*好是收集完成后馬上變性并于-80℃分裝保存，以保證降解程度*小。同時避免反復凍溶導致磷酸基團的降解。
• 關于/Western Blot操作問題
• 磷酸化蛋白的表達豐度較低，一般只有總蛋白量的10%，甚至更低，一定要確保每個凝膠孔中有足夠的目的蛋白上樣量。
• 磷酸化蛋白容易脫磷酸化，除提取蛋白時要迅速小心外，也可在上樣緩沖液和轉移緩沖液中加入磷酸化酶抑制劑Na3VO4等。
• 磷酸化抗體的好壞是一個關鍵因素，所以要選擇好的廠商。好抗體，傻瓜也能做出來，不好的抗體神仙也無辦法。有些公司的抗體很好，有些公司的抗體很差（一些大公司同樣會有低劣產品），而且這一點對非磷酸化的抗原檢測也很重要。
• 因為磷酸化蛋白只占總蛋白量的極少部分，加入一抗后*好4℃過夜，保證抗體有充分的結合時間。4℃也可以使一抗重復使用多次。畢竟磷酸化抗體都挺貴的。二抗則室溫1h即可。4℃過夜，主要原因不是使抗體結合更好，而是蛋白抗原不容易從膜上脫落。蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附屬熱力學范疇，高溫下容易脫落。而抗體-抗原結合是熱力學與動力學問題，高溫容易結合是熱力學范疇，抗體、抗原濃度卻是動力學范疇。膜上的抗原脫落了，結合效率會低。
• 磷酸化蛋白WB時，用洗滌液漂洗時也要注意一下，搖床的轉速不要太快，洗的時間不要太長，孵育一抗和二抗之后分別洗3次，每次5min即可。寧愿深一些，總比做不出來強得多。另外，洗的時候，*好不要把幾張膜疊在一起洗。
• 關于/磷酸化抗體的說明書
• 磷酸化抗體的說明書大家一定要仔細看，并*好根據廠商的操作說明來操作實驗，這是實驗成功的保證。因為不同的磷酸化抗體公司推薦的操作步驟不同。比如upstate的gamma-H2AX就需要脫脂奶粉封閉，一抗、二抗也需要脫脂奶粉配制；而CST的一些抗體則是脫脂奶粉封閉，一抗、二抗用BSA配制。其中原因不詳，但是應該是非常關鍵的，我試過用BSA配gamma-H2AX，背景很高，目的條帶非常淡。
• 關于/WB時背景和條帶的問題
• 磷酸化蛋白WB時背景也往往較深，所以壓片時間要適當，不能太長或過短，太長則背景太深蓋住想要的那條帶，時間過短則可能沒有條帶或者條帶太淺。
• 洗滌液對*后的背景影響也較大，密理博（millipore）*近的說明書推薦用雙蒸水洗滌，我對比了TBST洗滌的膜，效果有一定差距，背景有效降低，即便壓片30min，背景仍然是可以忽略的。我想，雙蒸水充分減少了ECL反映中其他緩沖液的影響，應該是可取的。
• 做磷酸化蛋白WB時，除了目標蛋白的條帶以外，往往會出現非特異性的條帶。磷酸化抗體不好的話，甚至會壓出非特異性的條帶，反而沒有你想要的條帶，所以壓片后，一定要根據Markers比對一下你壓出的條帶分子量是否正確。
• 關于/蛋白總的表達量問題
• 研究完某一蛋白的磷酸化情況后*好也要研究一下該蛋白總的表達量。這有兩種方法，一是：相同的樣品在不同的孔中上樣兩次（可在相同的膠上，也可在不同的膠上），其一壓磷酸化蛋白，另一壓該蛋白總的表達量（包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白），甚至還可跑另一個膠，壓內標。但是一般不建議如此做，因為這樣比較時誤差還是較大的。因此，比較公認的，也是常用的方法，即用strip液將原先結合上的磷酸化抗體及二抗洗去，然后用同一張膜壓總蛋白。然后再洗脫一次，再壓內標。
• 關于/Strip時的問題
• Strip時一定要注意，膜一定要完全泡在strip solution中（可用較硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，使受熱均勻。這一點很重要，要不然，隨后壓出來的總蛋白也好，內標也好就會不均一，無法進行比較。
• strip液是用來去除已結合的抗體，但也會去除部分的蛋白，導致蛋白信號變弱。實驗發現水浴有時溫度不穩定，溫度定為55℃時往往其溫度容易超過，導致較多的蛋白也被去除，故建議溫度設為50℃，30min，既能有效去除已結合的抗體，又比55℃更能保護蛋白。